科学发展｜武汉大学开发新的方法，更好地检测R环在基因组的形成
R环是独特的三链结构，其参与多个关键的生物学过程，并且与人类疾病有关。准确而全面的R环分析是R环研究的前提。然而，当前的R环映射方法产生较大的差异，因此迫切需要一种独立的方法。
2021年2月17日，武汉大学梁凯威及房萍萍共同通讯在Science Advances 在线发表题为“Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor”的研究论文，该研究通过结合人工CUT＆Tag和GST-His6-2×HBD建立了一个独立的R环CUT＆Tag方法，可特异性识别DNA-RNA杂交体。
该研究证明了R环CUT＆Tag对于高分辨率的天然R环映射是灵敏的，可重现的且方便的，并且发现捕获策略很大程度上导致了不同方法之间的差异。与传统的R环作图方法相比，R环CUT＆Tag在启动子处提供了卓越且高度特异性的R环信号，并能够检测基因体和增强子区域的瞬时R环。在一起，该研究为天然R环的基因组分析提供了一种独立的策略，并有助于解决多种R环映射方法之间的差异。
R环是一种特殊的三链核酸结构，当新生RNA在转录过程中侵入双链DNA（dsDNA）时形成，形成DNA-RNA杂合体和置换的单链DNA（ssDNA）。从细菌到哺乳动物，R环广泛存在。尽管R环仅被视为转录的“副产物”，但越来越多的证据表明R环参与了各种关键的生物学过程，例如基因组稳定性维持，转录调控，DNA损伤修复和染色质结构的调控。最近，已证明调节R环的功能障碍与多种人类疾病有关，包括癌症，神经系统疾病和免疫疾病。
研究R环在生理和病理过程中的功能和调控依赖于人类基因组中R环的准确而全面的分析。在过去的十年中，开发了几种全基因组的R环作图方法，使用S9.6单克隆抗体（mAb）或催化失活的核糖核酸酶（RNase）H1来特异性结合DNA-RNA杂种（R环的定义特征）并捕获。当前，R环全基因组分布分析的主要策略是DNA-RNA免疫沉淀测序（DRIP-seq），该技术可在测序前使用S9.6抗体捕获含DNA的R环片段。DRIPc-seq源自DRIP-seq，并且对杂种的RNA成分进行特异性测序。然而，最近有人质疑S9.6抗体的特异性，以对真正的R环进行精确定量和定位。此外，限制酶的消化效率和染色质片段化的偏倚可能会损害DRIP相关方法中的R环作图分辨率。
R环参与多个生物学过程，尤其是转录延伸。已经显示，R环通过充当障碍物而损害转录延伸，R环也与基因启动子附近的转录暂停相关。由于R环功能障碍和转录延伸控制与人类疾病有关，因此R环的精确而全面的定位对于研究这些疾病中R环的功能和机制至关重要。已经显示出不同的R环映射方法会在R循环分析中产生较大的差异，尤其是R环的基因组分布。因此，迫切需要独立于S9.6或无催化活性的RNase H1的R环作图方法，以澄清争议。
RNase H1的N末端杂交结合结构域（HBD）是一个短蛋白结构域，由三链反平行β折叠和两个短螺旋组成。HBD以非序列特异性方式介导DNA-RNA杂合体的特异性识别，这突显了HBD结构域本身作为R环作图的潜在感应器。最近，据报道Tn5转座酶随机结合DNA-RNA杂合并将衔接子转座到DNA-RNA杂种的两条链上。此外，转座后的产物可能发生链转移，可直接用于测序文库的制备，从而节省了许多耗时的步骤。将Tn5系统用于DNA和DNA-RNA杂合的标签化，将潜在地避免由于限制性内切酶消化引起的片段化偏倚。
为了测试使用HBD和Tn5转座酶进行R环图谱分析的可能性，该研究构建了两个带有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签和带有六个组氨酸（His6）标签的人工感应器蛋白与HBD串联重复（GST-His6-HBD和GST-His6-2 ×HBD），并建立了一个独立的系统来进行本地R环映射。
首先，该研究发现与体外其他核酸结构相比，含HBD的感应器蛋白对DNA-RNA杂合体表现出高特异性，GST-His6-2×HBD蛋白的行为与DRIPc-seq中的S9.6抗体相似。此外，该研究将R环感应器蛋白GST-His6-2×HBD或S9.6与最近开发的在靶标和标签技术（CUT＆Tag）下基于Tn5的裂解相结合，并建立了一种称为R环的天然映射方法R环CUT＆Tag。与传统的R环作图方法相比，R环CUT＆Tag在启动子处提供了卓越且高度特异性的R环信号，并能够检测基因体和增强子区域的瞬时R环。总之，该研究通过提供一种独立的方法来准确，全面地描述整个基因组中的天然R环，从而阐明了不同R环作图方法之间的争议。
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